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技術文章
Technical articles
更新時間：2016-06-21
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單抗制備常見問題分析
1. 為什么我的細胞生長很慢？
答：可能的原因：
（1）使用了劣質的培養(yǎng)耗材、培養(yǎng)基、血清、HAT或HT。建議新手使用廠商的試劑或耗材。對于血清，可能需要從多個廠家選用多個批次試用，選擇出比較好的批次進行實驗。在試用血清的時候，一般可以使用相對較低濃度的血清進行骨髓瘤細胞培養(yǎng)實驗，根據(jù)骨髓瘤細胞的倍增速度確實血清質量。
（2）使用的血清或培養(yǎng)基濃度不正確。仔細檢查配方是否正確。
（3）制備飼養(yǎng)層的方法不正確。參見本頁面第二個問題。
（4）其它問題，可以參考本頁面第二個問題。
2. 為什么融合后細胞不長或者融合后克隆很少？
答：可以從這幾個方面考慮：
（1）免疫用的動物品系不正確或者品系不純。免疫用的動物一般應該與骨髓瘤來源的動物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤細胞時應該選用Balb/C小鼠，同時必須使用品系純正的小鼠。
（2）培養(yǎng)基中加入了過高濃度的HAT，或者僅A的濃度過高或HT的濃度過低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。
（3）培養(yǎng)基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質血清。
（4）未正確制備飼養(yǎng)層細胞。參見本站有關飼養(yǎng)層細胞制備的部份。
（5）接種雜交瘤細胞的培養(yǎng)板過多。一般在5-20塊96孔板為宜。
（6）融合后，未及時轉移或稀釋細胞。有人在做融合后喜歡把融合的細胞先放在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，然后再滴到96孔板上。如果在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的時間過長，也可能出現(xiàn)克隆利率少的情況。
（7）細胞被污染。在顯微鏡下仔細觀察是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應該考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測。
（8）細胞培養(yǎng)條件不正確，確保細胞培養(yǎng)在恒定的37度較濕的環(huán)境，同時保證CO2濃度在4-5%左右。
（9）其它與融合條件相關的不恰當?shù)囊蛩亍Ｔ斠姳菊居嘘P細胞融合的部份。
3. 為什么我凍存的細胞很難復蘇或者復蘇不活？
答：這個問題要從兩個方面來回答，一是凍存方面，二是復蘇問題。 對于凍存過程，需要注意：
（1）凍存液的配方。這個問題很關鍵，一個良好的凍存液配方可以使細胞保存得非常好，而一個不好的凍存液配方可能會讓細胞傾刻死亡。目前認為比較好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基，不管是哪一種，凍存保護劑DMSO的含量非常重要，如果這個濃度過低，則起不到保護作用，凍存的細胞終會死于冰晶形成時的張力，如果濃度過高，則細胞中毒而亡。如果使用第二個配方，注意一定要用養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基，而盡量不要用一般的*培養(yǎng)基，而且一定是配養(yǎng)需要凍存的那一株的培養(yǎng)基。文獻中也有提到用甘油作為凍存保護劑的，站長自己沒有親自試過，不發(fā)表評論。如果新手確實對這個沒把握，上也有商品化的凍存液，買回來按照說明書操作就OK了。
（2）凍存過程中，不可用力過大，在凍存液中重懸細胞的時候更是要輕柔，因為在DMSO存在的條件下，細胞膜變得非常脆弱，如果用力過猛，則細胞膜很容易破，復蘇成活的機會就明顯會下降。
（3）凍存的程序也非常重要。實踐表明，以每分鐘1 ℃的速度下降凍存細胞是的。如果條件簡易，可以把細胞放在4 ℃半小時左右，然后再在-20 ℃放置1-2小時，后轉入-80 ℃放置一晚上，終轉入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。現(xiàn)在上有比較貴的凍存盒，把需要存放的細胞放進去，然后直接放-80 ℃就行，等時間夠長后直接轉至液氮中即可。
（4）細胞需要保存在液氮的氣相中，而不是泡在液相里。否則液氮很容易進入凍存管。這一點很多人都沒有注意，大部份人都是直接往液相里放，其實這是錯誤的。有人認為，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，這些微生物或孢子就有機會進入凍存管，終可能造成細胞污染。
（5）保證被凍存的細胞處于良好的生長狀態(tài)，并且沒有被污染。
4. 為什么免疫后沒有效價或免疫后效價低？
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